软骨缺损在运动损伤中是最常见的,容易导致形成骨性关节炎,引发疼痛、关节畸形等症状。存在于关节中的软骨细胞分化完全、成熟度高,致使其非常弱的再生能力,外加在软骨周围没有神经、血管及淋巴组织,所以靠自身来修复的可能性显得微乎其微。随着组织工程技术的发展,修复软骨损伤这一难题将逐渐得到解决。
利用生物3D打印技术,首先考察实验仪器参数对组织支架结构以及孔径的影响。以2g海藻酸钠和6g明胶作为打印基材,制备出的复合凝胶呈现透明状、粘度适中且材料的流体性能良好。通过考察打印气压、打印速度、打印针头直径和打印间距对支架形貌的影响,确定出0.30Mpa、16mm/s、300μm和0.8mm是最优的制备参数,制备出的支架结构规整、孔孔贯通性良好。
其次,对制备出的SA/Ge复合凝胶支架的性能进行简单的研究。热稳定性实验表明,复合支架相比纯海藻酸钠支架具有更好的稳定性能;支架溶胀结果发现,复合凝胶支架在4h内就达到其最大溶胀率,为713%;从复合支架的降解实验结果得出,CaCl2对海藻酸钠交联度较低且主要交联支架的外部结构;对支架的浸提液做毒性分析,与正常培养基相比没有显著性差异,表明制备出的支架安全无毒。
体外培养C5.18细胞,由生长曲线可以发现它是一种快速增殖的细胞,光镜观察发现细胞呈三角形或多角形。HE(Hematoxylin-Eosin)染色结果可见软骨细胞典型形态;阿利新蓝和番红的染色结果表明,培养的软骨细胞能够合成分泌蛋白聚糖和糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG);淫羊藿苷(ICA)对软骨细胞的作用表明,0.1-100μg/mL的ICA对软骨细胞增殖和分泌都有一定的促进作用,且10μg/mL的促进作用更加明显,MTT与GAG的实验结果相互印证。
最后,将软骨细胞接种在复合支架上,观察细胞生长和分泌状况。SEM结果表明,5h时细胞完全舒展开来,展现出细胞的不规则多边形形状;7h时舒展的细胞与细胞之间相互作用并连接起来,形成细胞团聚体。激光共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞在支架上的分布状况和死活情况,发现细胞大部分分布在支架的褶皱里和孔洞里,在支架表面上分布的细胞量很少。细胞死活实验结果表明,随着层厚的加深细胞的数量明显减少,培养三天后发现呈现出一定量的死亡现象。梯度ICA作用支架上的软骨细胞,由MTT实验和GAG分泌检测情况表明,10μg/mL相对其它梯度促进效果更显著,100μg/mL相比抑制了细胞的增殖。
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